После того, как лаборатория получает новую клеточную линию, эту клеточную линию необходимо сначала культивировать и размножить, а затем заморозить. Криоконсервация клеток в первую очередь может быть использована в качестве резерва, когда клетки теряются из-за загрязнения и других условий. Кроме того, почти все клетки претерпевают определенную степень изменчивости в процессе культивирования и пассирования. Чтобы сохранить согласованность экспериментальных результатов, обычно клетки нельзя культивировать в течение десятков поколений. При повторном использовании необходимо разморозить и культивировать криоконсервированные, менее пассированные клетки перед использованием.
В процессе замораживания клеток есть четыре основных момента: сбор клеток, использование защитных средств, скорость замораживания и условия хранения.
Сбор клеток
Клетки, используемые для криоконсервации, обычно выбирают, когда клетки имеют приблизительно 90% конфлюэнтность. В это время рост клеток хороший, а количество клеток большое, и культуральную среду следует менять за 24 часа до сбора клеток. Метод сбора клеток для криоконсервации такой же, как обычно. Центрифугируйте при 100xg в течение 5 минут, чтобы собрать клетки и ресуспендировать их. Подсчитывают живые клетки. Разбавьте или сконцентрируйте в два раза по сравнению с конечной концентрацией клеток для сохранения клеток (обычно 4-10 миллионов клеток/мл), добавьте равный объем приготовленного раствора смеси защитного агента для культуральной среды, осторожно перемешайте и аликвоту в пробирку для криоконсервации, криоконсервация.
Использование защитных средств.
При криоконсервации клеток ДМСО обычно используется в качестве защитного агента. При криоконсервации клеток конечная используемая концентрация ДМСО обычно составляет 5-15%. Концентрацию ДМСО в растворе для криоконсервации конкретной клетки можно найти в ATCC. Для особо чувствительных клеток, особенно клеток гибридомы, может быть лучше использовать 95% сыворотку и 5% ДМСО при криоконсервации. При использовании защитного агента используйте культуральную среду или сыворотку, чтобы удвоить конечную концентрацию, а затем смешайте ее с равным объемом суспензионной среды для культивирования клеток. Скорость замораживания клеток
Скорость замораживания клеток лучше всего контролировать, чтобы дать клеткам достаточно времени для обезвоживания без повреждения чрезмерной дегидратацией. Для большинства ячеек допустимо падение температуры на 1–3°C в минуту. Обычная операция заключается в том, чтобы поместить клетки при -20°C на 1-2 часа, затем поместить их в холодильник -80°C на ночь (если нет холодильника -80°C, вместо него можно использовать сухой лед) и затем перенесите в резервуар с жидким азотом или ниже -130. Длительное хранение в холодильнике при ℃.
Среда хранения
Температура длительного хранения ячеек составляет -130 ℃ или ниже. Температура газообразного слоя в резервуаре с жидким азотом составляет от -140 ℃ до -180 ℃. Клетки можно хранить в газовом слое или погружать в жидкий азот. Если возможно, лучше всего хранить в газообразном слое, потому что это может предотвратить попадание жидкого азота в морозильное хранилище. Трубка вызывает взрыв, когда клетки вынимаются (но таким образом в резервуаре с жидким азотом может храниться лишь небольшое количество жидкого азота, который необходимо часто добавлять). Клетки также можно хранить в холодильнике при температуре -80 ℃ в течение нескольких месяцев или около того.
英语
阿拉伯语
简体中文