1. Клетки, подлежащие криоконсервации, должны быть в состоянии хорошего роста (логарифмическая фаза) и высокой выживаемости с плотностью около 80-90%.
2. Перед заморозкой проверьте, сохраняют ли клетки свои уникальные свойства.
Например, гибридому следует проверить на выработку антител за один-два дня до криоконсервации.
3. Обратите внимание на качество криопротектора.
ДМСО должен быть химически чистым, стерильным и бесцветным (отфильтрованным с помощью 0,22-микронного FGLP Telflon или приобретенных напрямую стерильных продуктов, таких как Sigma D-2650), разделенных на аликвоты небольшими объемами по 5-10 мл, хранящихся при 4 oC в темноте. Не размораживайте несколько раз. Глицерин также должен быть химически чистым и после автоклавирования храниться в темноте. Использовать в течение одного года после вскрытия, так как при длительном хранении он будет токсичен для клеток.
4. Концентрация клеток для криоконсервации:
(1) Нормальный человеческий фибробласт: 1~3 x 106 клеток/мл.
(2) Гибридома: 1~3 x 106 клеток/мл, концентрация клеток не должна быть слишком высокой, некоторые гибридомы погибнут после оттаивания в течение 24 часов из-за высокой концентрации при замораживании.
(3) Приросшие опухолевые линии: 5~7 х 106, в зависимости от типа клеток. Аденокарцинома требует более высокой концентрации после оттаивания, в то время как для HeLa требуется всего 1-3 x 106 клеток/мл.
(4) другие суспензии: 5~10 х 106 клеток/мл, лимфоциты человека должны быть не менее 5 х 106 клеток/мл.
5. Концентрация криопротектора составляет 5 или 10% ДМСО. Если условия замораживания клеток неясны, следует использовать резервную культуру при криоконсервации, чтобы предотвратить отказ от замораживания.
6. Метод заморозки:
(1) Традиционный метод: 4 oC 10 минут ---> -20 oC 30 минут ---> -80 oC 16-18 часов (или на ночь) ---> Длительное хранение в паровой фазе резервуара с жидким азотом .
(2) Программное охлаждение: Используйте охлаждающую машину с постоянной скоростью для снижения температуры от комнатной до –120 oC со скоростью –1 ~ -3 oC/мин и храните ее в паровой фазе резервуара с жидким азотом в течение длительного времени. срок хранения. Он подходит для сохранения суспензионных клеток и гибридом.
7. Материал:
(1) Культивируемые клетки, которые хорошо растут
(2) Свежая среда
(3) ДМСО (Sigma D-2650)
(4) Стерильная пластиковая пробирка для криоконсервации (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4% вес./об. трипанового синего (GibcoBRL 15250-061)
(6) Планшет гемоцитометра и покровное стекло
(7) Охлаждающая машина с постоянной скоростью (KRYO 10 Series II)
8. Шаги:
(1) Смените половину или полное количество среды за день до замораживания и наблюдайте за ростом клеток.
(2) Приготовление раствора для криоконсервации (приготовление перед использованием): добавьте ДМСО в свежую среду, конечная концентрация составляет 5-10%, хорошо перемешайте и поставьте при комнатной температуре для последующего использования.
(3) В соответствии с операцией пересева клеток соберите культивированные клетки и возьмите небольшое количество клеточной суспензии (около 0,1 мл) для подсчета концентрации клеток и выживаемости перед замораживанием.
(4) Отцентрифугировать, удалить супернатант, добавить необходимое количество раствора для криоконсервации, чтобы концентрация клеток составила 1-5 х 106 клеток/мл, хорошо перемешать и влить в маркированную пробирку для криоконсервации, 1 мл/флакон, и взять небольшой количество клеточной суспензии для обнаружения контаминации.
(5) Метод криоконсервации 1: Криопробирку помещают при 4 °C на 10 минут → -20 °C на 30 минут → -80 °C на 16–18 часов (или на ночь) → паровую фазу резервуара с жидким азотом для длительного хранения.
(6) Способ хранения при замораживании 2: трубка для замораживания помещается в охлаждающую машину с постоянной скоростью с заданной программой, а затем помещается в резервуар с жидким азотом.
英语
阿拉伯语
简体中文